近年来，细胞与基因治疗（Cell&GeneTherapy, CGT）领域取得了显著突破。以anti-CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在攻克血液瘤方面获得了成功，而基于AAV载体的基因疗法为罕见病提供了新的治疗方案。此外，CRISPR基因编辑技术的发展更是推进了基因治疗的进程，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，而体内基因编辑疗法也展现了令人满意的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性问题引发了广泛关注。由于其直接作用于基因组DNA，任何不精确的改动均可能带来长期风险。因此，FDA等监管机构针对基因治疗的安全性提出了指导原则，重点关注两个方面：一是基因组完整性的评估，包括染色体重排、大块插入或缺失、外源DNA整合及其潜在致癌性；二是识别脱靶编辑活动，包括类型、频率和位置。本文将详细介绍各类脱靶检测技术，以确保基因编辑的安全性和有效性。

脱靶效应与检测技术

脱靶效应（Off-target effect）指的是在基因编辑过程中，CRISPR-Cas9等工具除了对目标序列进行编辑外，还可能错误地作用于其他与目标序列相似的非目标位点，导致意外的基因组改变。因此，为了确保基因编辑的安全性，已经开发了多种检测和评估脱靶效应的方法。这些检测方法可分为体内检测和体外检测两大类。

体内检测方法

体内检测方法是指在活细胞或生物体内进行的脱靶效应评估，通常更接近真实的生物环境。

GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的强大工具。其原理是通过向细胞内引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），该标记物可以插入到由Cas9产生的DNA双链断裂（DSBs）位点中。随后，利用高通量测序技术识别这些被标记的位点，从而全面发现潜在的脱靶位置。

✔ 优点：提供全基因组层面的脱靶位点信息；直接检测体内真实的双链断裂事件；能够识别低频的脱靶事件。

✖ 缺点：实验操作复杂，对技术水平要求高；可能会错过那些不易被标记的脱靶位点，对于某些难以转染的细胞类型实施难度较大。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种新颖的方法，用于检测CRISPR-Cas9基因编辑过程中的脱靶效应。该方法监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化，以揭示潜在的脱靶位点。通过识别和测序因Cas9活性而中断的结合位点，可定位全基因组范围内的脱靶位置。

✔ 优点：能够在活细胞中实时监控Cas9-DNA相互作用；提供非侵入式检测手段，减少对细胞生理状态的干扰。

✖ 缺点：实验设计复杂，需要特定设备和技术支持；对于某些难以转染的细胞类型可能不适用；分析流程较为繁琐，数据解读需专业知识。

体外检测方法

体外检测方法是在实验室条件下，使用从生物体提取的成分或合成的材料进行的测试，这些方法可提供对特定因素的精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种高通量测序方法，用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应。其原理是利用纯化基因组DNA模仿Cas9核酸酶的切割作用，通过将Cas9与sgRNA引入基因组DNA样本进行消化处理，再对消化后的DNA进行全基因组测序，利用生物信息学工具识别并量化由Cas9造成的双链断裂位点。

✔ 优点：无偏见地在全基因组水平鉴定脱靶位点；提供比计算预测更高的准确性；操作相对简便。

✖ 缺点：可能遗漏仅在细胞内环境中发生的脱靶事件；需要大量的起始DNA和高级测序设备，成本较高；数据分析流程复杂。

WGS全基因组测序

全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）是一种用于确定个体基因组中所有DNA序列的技术。WGS对整个基因组进行分解并高通量测序，能够识别出包括单核苷酸变异（SNVs）、插入缺失（indels）在内的遗传变异。

✔ 优点：提供最全面的基因组信息，涵盖编码区和非编码区；能够发现各种类型的遗传变异，深入理解基因功能及其与疾病的关系。

✖ 缺点：数据量庞大，需强大的计算资源和专业生物信息学分析能力；对于某些重复区域或复杂的基因组结构，准确组装仍具挑战。

无论是在科研还是临床应用中，CRISPR技术都伴随巨大潜力与风险，其中脱靶现象尤其受到更多关注。本文介绍了多种主流的CRISPR脱靶检测方法，但没有一种适用于所有情况。全面评估CRISPR脱靶风险需要结合多种检测方法。我们期待更多高效准确的脱靶检测手段的出现，进一步提升基因编辑技术的安全性与可靠性。

尊龙凯时在过去的2年中建立了一站式基因编辑安全性评估平台，覆盖靶点设计、靶点筛选、脱靶检测等多种不同管线。附带SGS认证、ISO9001质量体系认证及生物安全二级实验室设施，尊龙凯时可持续为客户提供高效、安全的服务及产品。这些优势确保了在生物医疗领域，采用尊龙凯时的解决方案能够有效降低基因编辑中的脱靶风险，保障患者安全。